干货分享--细胞的冻存、复苏以及活率测定

      冻存通常是指将细胞冷冻储存在-196℃的液氮中。如在不加任何保护剂的情况下，直接对细胞加以冻存，会导致细胞内、外的水分迅速形成冰晶，进而对细胞结构与功能造成一系列的损害，如机械损伤、蛋白质变性、电解质升高等，最后可引起细胞死亡。为了避免细胞内冰晶的形成，在冻存细胞时常向培养液中加入适量的二甲亚砜（DMSO），因其相对分子质量较小而溶解度大，较易穿透进入细胞中，使细胞内冰点下降，并可提高细胞膜对水的通透性，配合以缓慢冷冻的方法，可使细胞内的水分逐步地渗透出胞外，避免了冰晶在细胞内大量的形成。

      复苏是指将冻存的细胞从-196℃的液氮中取出融解，使其活力恢复的过程。快速融化的手段可以保证细胞外结晶在很短时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞重新结晶对细胞造成损害。复苏成功的细胞可以保持很高的活力。

细胞的冻存：

1.用0.25%胰蛋白酶溶液消化处于对数生长期的单层培养细胞，收集消化的细胞于15mL离心管中；

2.800-1000rpm离心5min，弃上清；

3.加入适量冻存液（百澳博无DMSO细胞冻存液），用吸管吹打细胞制悬，调整细胞密度为5×106-1×107个/mL；

4.每个冻存管分装细胞悬液1mL，旋紧冻存管的盖；

5.在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间、冻存人名等；

6.将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存：-80℃，12h→液氮；

7.若使用含10%DMSO和10%FBS的培养液冻存细胞，则将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存：4℃，1h→-20℃，2h→-80℃，12h→液氮。

细胞复苏和活率测定：

1.用止血钳从液氮罐冻存盒中取出细胞冻存管1只，迅速将其置入37℃水浴中，不断摇动使冻存的细胞悬液尽快融化；

2.用酒精棉球擦拭冻存管，放入超净工作台中；

3.将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中，加10倍体积的RPMI 1640培养基（含10%小牛血清），吹打混匀；

4.800-1000rpm离心5min，弃上清液；

5.加入培养液吹打沉淀的细胞，使其悬浮，将细胞悬液与0.4%的台盼蓝溶液以9:1的比例混合。‌在室温下染色3-5分钟，对细胞进行计数，计算活细胞比例；

6.按1×105个mL的细胞浓度，将细胞接种在培养瓶中，置于培养箱中培养；

7.24h后取出培养瓶，观察细胞生长状况。

注意事项：

1.对数期的细胞增殖能力强，冻存后生存率较高，因此，在进行细胞冻存时，应尽量选择处于此期的细胞加以冻存；

2.为了保证冻存的质量及复苏后细胞的存活率，冻存时应掌握好消化时间，消化过度将对细胞造成损伤，复苏时细胞难于存活。此外，复苏后接种时，细胞的浓度不能太低，最好控制在1×105-5×105个/mL，这样才能保证复苏成功；

3.冻存管的管盖应封盖严密，以免复苏时细胞外溢；

4.复苏时，从液氮取出冻存管到水浴中融化的过程要快，否则将会导致冰晶的形成，伤害细胞。同时，一次复苏的冻存管数量不要太多，否则会引起水浴锅中传热不佳，延缓冻存的细胞悬液融化的时间；

5.为防止液氮冻伤，在复苏过程中应戴上棉质手套。

细胞增殖情况：

                             24h贴壁状态                                                                                               48h增殖情况                                                                             72h增殖情况（细胞汇合度达90%）