实验小知识--如何进行正确的细胞计数实验？

【实验原理】

   细胞计数板的中央有两个细胞计数池，上面有激光蚀刻形成的网格；网格由9个主要方格构成，角上的4个方格进一步分成16个较小的方格，中央的主要方格被分为25个较小的方格，每一个较小方格被进一步分为16个微型方格，在每个细胞计数池的远端是上样口，待计数的细胞悬液从此处加入。通过计算出一定体积细胞悬液中的细胞数目换算出每毫升细胞悬液中的细胞数。

【实验步骤】

Step1

制备细胞悬液：

①贴壁生长的细胞，使用胰酶消化的方法使细胞从培养瓶表面脱落；

②漩涡混匀或使用移液器反复吹吸细胞悬液，尽量减少细胞团簇；

③悬浮细胞则可以直接进行取样计数；

④细胞悬液的计数浓度：5×10⁵个细胞/mL -5×10⁶个细胞/mL。

注意：

1.尽量少、尽量小的细胞团簇；

2.如需计算活率，则需将细胞悬液按照1：1的比例加入等量的0.4%的台盼蓝染料，混匀后，静置1~2分钟。

Step2

2.用纯水和75%乙醇清洗血细胞计数板表面和盖玻片，然后用洗耳球吹干，在血细胞计数板的计数池上方盖上专用的盖玻片；

    注意：最好不要擦拭血细胞计数板的计数池，防止标示线损坏。

Step3

 吸取10ul细胞悬液沿着盖玻片一侧缓慢滴加，使细胞悬液填充盖玻片与计数板之间，注意盖玻片下不能有气泡，亦不可让悬液滴入旁边凹槽中；

Step4

 将细胞计数板置于普通显微镜下（10×4）观察，统计血球计数板的四大格中细胞的总数，压线细胞遵守“计左不计右，计上不计下”的原则；

Step4

    细胞悬液中的细胞数目按照以下公式计算：

【注意事项】

1.取样计数前，充分混匀细胞悬液，减少测量误差；

2.若大方格内细胞数过多，应当对细胞悬液进行适当稀释后再计数；

3.若每个大方格内的细胞数目相差20个以上，表示细胞分布不均，必须对细胞悬液混匀后重新计数；

4.若显微镜下见有两个或以上的细胞组成的细胞团，则需按单个细胞计算，若出现多个细胞团，可能原因为细胞悬液未充分混匀或稀释倍数不够，需要重新混匀或适当稀释后再次计数；

5.一个细胞计数板有两个细胞计数池，为了避免误差，可重复计数，取平均值。