提取的RNA总是降解？问题可能出在耗材上

耗材--无RNase

    RNA实验中最重要的方面是分离完整的RNA并保护其不被降解，以便进行分析或作为反应底物。无论是为下一代测序（NGS）准备全RNA文库，还是研究单个RNA（iCLIP技术），未降解的RNA都是至关重要的，而阻碍这些过程的是RNA酶。

 以【聚立离心管】为例进行分析：

    核糖核酸酶（RNase）是一类能将RNA水解的酶，核糖核酸酶分为两类：核糖核酸内切酶和核糖核酸外切酶。RNA比DNA更容易降解，这是由于其2´羟基有充当亲核试剂的能力。许多核糖核酸酶（rnase）通过利用2´羟基作为反应物质而绕过了对金属离子的需要。这些核糖核酸酶对金属螯合剂具有抗性，其中一些酶，如核糖核酸酶A，可以在长时间煮沸或高压灭菌中存活。RNase A型酶依靠活性位点组氨酸残基获得催化活性[1]，可被组氨酸特异性烷基化剂焦碳酸二乙酯（DEPC）灭活。

    RNase在环境中无处不在，特别是在一些生物材料中，它以相对较高的浓度存在。RNase 还经常污染常见的分子生物学试剂，如反应缓冲液、酶，如逆转录酶和RNA聚合酶，以及用于RNA纯化和储存的缓冲液。在实验中，通常使用DEPC或加热去除RNase。即使是微量的核糖核酸酶（RNase）污染也会破坏涉及RNA的实验，

    因此，有必要评估耗材中RNase的存在。

“RNase检测方法”

1.核酸电泳法

原理：以RNA-Ladder作为标志物，通过观察电泳条带的完整性判断是否含有RNase，是分子生物学实验中常用的检测方法。

步骤：用无RNA的水依次润洗15个待测样品后，取17μL润洗液转移至无RNA酶离心管中，与3μL含100bp RNA-Ladder的RNase-buffer混合，阳性对照加入RNase标准品，以无DNA的水代替润洗液作为阴性对照。所有样品于37℃孵育24h，通过琼脂糖凝胶电泳观察RNA-Ladder的降解情况，判断是否含有RNase。

                                            图1 核酸电泳法实验效果[2]

    缺点：1、耗时长：需要孵育24h，需要制胶、灌胶、冷却和电泳，不能快速出结果；2、需要RNase、RNA-Ladder标准品，市面上的这些标准品质量难以控制且价格昂贵，且RNA-Ladder不稳定，极易降解。3、步骤多，容易污染，且无法定量。

2.荧光探针底物法

    针对无酶塑料离心管应不含RNA酶。本公司采用RNase检测试剂盒，根据说明书，样本检测值应低于2倍阴性质控品荧光值的均值，检测结果为阴性。

    原理：基于荧光探针法的DNase及RNase残留活性检测有赖于荧光团标记的RNA和DNA底物。当样品中不含RNase和DNase活性时，底物稳定，荧光基团和淬灭基团距离较近，由于荧光共振能量转移原理，不产生荧光信号；当样品含有RNase和DNase活性时，底物降解，荧光基团和淬灭基团相互远离，从而产生逐渐增强的荧光信号；荧光信号的增加速率与酶的数量和活性呈正相关。

                                图2 荧光探针底物法原理[3]

    通过使用荧光微板读取器在ex/em=490/520nm波长下测量可以确定样品是否有RNase污染。本方法对样品中RNase的检出限为0.03125pg/孔(3.13E-08U/孔)。

    优点：1、灵敏度高，最低检出限低至0.03125pg/孔(3.13E-08U/孔)；2、使用简单快捷，30min内即可完成80+样本检测。

   待测样品：

  试剂、耗材和仪器

“实验方法”

   实验环境：为了确保实验的准确性，实验环境要求操作过程不引入额外的 RNase。实验操作在超净工作台（ISO5）上进行，清洁超清洁工作台中的操作表面，并打开超净工作台进行30min以上的紫外线照射。

   仪器准备：打开Varioskan ALF™酶标仪，编辑样品序列，并设置如下参数：

   准备无核酸酶水：往纯水中加入0.1%(v/v)的焦碳酸二乙酯(DEPC),121℃灭菌30min，即得。

   待测样品处理：50mL、15mL离心管：取320μL无核酸酶水于无核酸酶1.5mL离心管中，用DNA采样拭子沾取后依次擦拭4个待测样品内壁，浸泡30min，取80μL于96孔板中，每样品平行加2孔；

   1.5mL离心管：每样品取20支，同法处理；

   200μL吸头：取240μL无核酸酶水于无核酸酶1.5mL离心管中，依次润洗30个待测tip，取80μL于96孔板中，每样品平行加2孔。

   准备空白和标准曲线样品：

    按下表和试剂盒说明准备空白和标准曲线样品：

   上机检测: 按试剂盒说明书，往上述制备的样品、标准品、空白孔中加入荧光底物，立即置于酶标仪中，按上述设置好的程序运行和采集实时荧光读数。

   数据处理: 获得RNase A标准品的实时荧光数据如图3.

                                              图3 RNase A标准品实时荧光数据

     以反应结束时(第40min)的荧光值为因变量，进行四参数拟合。与线性拟合、传统的Logistic拟合相比，四参数log-logistic拟合在如含量（如ELISA含量测定）、活性（包括结合活性和生物学活性）数据分析中都具有明显的优势。在活性分析中，四参数拟合能获得拟合度更好的S型曲线，特别是方程的4个参数都有着现实意义，从而对于判断和理解实验结果有着巨大的帮助，因而数据分析中起着关键作用[4]。四参数拟合的方程为：

                  y=（A-D）/（1+（x/C）^-B）+D

    其4个参数都有着很好的现实意义。其中D表示荧光下限值，代表着S型曲线的下渐近线；而A表示荧光上限值，代表着S型曲线的上渐近线。C为荧光增长速率开始发生变化的浓度值，即半效反应浓度(EC50)。B为荧光增加速率参数，相当于曲线的斜率。即这个方程可以写为：

                Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+((X/EC50)^-HillSlope)

    大多数的中高端酶标仪都会配备带有数据收集和处理软件，如本实验用到的Thermo Fisher Scientific®的Varioskan ALF™，只需编制好相应的模板，即可自动获得拟合图和计算结果（如图4），有的型号的软件还可以完成平行性检验等更高阶的功能。在日常数据的处理中，也可以用一些统计软件如Origin、GraphPad Prism来进行四参数拟合，但这些软件不具备常用的96孔板布局功能，需要前期在Excel中计算吸光度平均值、设置标准品和样品浓度等，因此在使用上是存在一定的限制。

                                                                图4 RNase A的四参数拟合曲线

    以反应初速率为因变量进行线性回归：在底物过量的情况下，酶促反应速率与酶活力成正比，故可以前4min的平均反应速率作为初始反应速率，对酶浓度进行线性回归，得图5所示回归曲线。

                                                                  图5 反应初速率-RNase浓度曲线

    结果与讨论：所测聚立®50mL离心管，聚立®、Corning® 15mL离心管，聚立®、Eppendorf® 1.5mL离心管，聚立®、Axygen®、RAININ® 200μL tip中均未检出RNase，各类型样品对应检出限换算如下：

    关于酶活力数值的问题，由于本实验的底物为寡聚核苷酸探针，比核酸电泳法的底物--100bp左右的RNA marker序列更短，更易降解(只需降解少数几个磷酸二酯键，使荧光基团和淬灭基团分离即可，图6)，且荧光酶标仪对荧光信号的响应远比核酸电泳中Eb染色后紫外成像仪中观察条带形状和曝光强度的变化灵敏度高。故相同浓度的RNase，以100bp RNA marker为底物对应的酶活力数值应远低于以荧光探针为底物对应的酶活力数值。

                                                            图6 荧光基团和淬灭基团标记的寡聚RNA探针降解示意图[5]

    实验室中RNase污染是一个常见的问题。RNase可来源实验人员，如皮肤、呼吸道和体液中都可能含有RNase，这些酶在实验过程中可以通过接触或气溶胶运输造成污染。一些廉价的实验耗材如试管、tip、离心管等在制造过程中未经过严格的去RNase处理，可能含有残留RNase。实验室环境中如空气、桌面等也是潜在的RNase污染源，这些外部因素也会影响实验结果。

    为了减少实验室中的RNase污染，建议采取以下措施：

1、使用RNase-free的耗材：推荐使用国产如聚立医疗®、百澳博生物®或进口如Corning®、Eppendorf®、Axygen®、RAININ®等的RNase-free耗材，以确保实验的可靠性。

2、使用无核酸酶的水和试剂:如往双蒸水中加入0.1%(v:v)的DEPC，混匀至完全溶解后，121℃高压灭菌30min，即得无核酸酶水，可作为溶剂或用来处理非RNase-free的耗材。(注:DEPC气味芳香浓烈，强挥发性，有毒，需在通风橱中操作。)

3、个人防护：在操作过程中戴手套和口罩，减少手部和呼吸道对样品的RNase污染。

4、环境控制：保持实验室的清洁，定期消毒工作台面，降低环境中的RNase含量。

敲重点

"为什么选择我们的产品？？？”

   原材料的把控：我们严格控制生产原料的质量，选择无核酸酶污染的原材料，从源头上防止核酸酶的引入；

   生产环节的把控：我们不仅依赖于紫外消毒程序和空气过滤系统，还引入了先进的生产设备和工艺，以最大限度地减少核酸酶的引入和生成。我们定期对生产设备进行清洗和消毒，确保生产环境的洁净度；

   储存环节的把控：我们采用了专门设计的储存设备和条件，以确保产品在储存过程中不会受到核酸酶的污染。我们设置了温度、湿度等参数的严格监控，并定期检测储存环境的洁净度和核酸酶含量；

   包装环节的把控：采用了密封性良好的包装材料，以防止外界核酸酶的侵入。在包装环节，我们同样注重防止核酸酶的污染。我们采用了先进的包装技术和材料，避免产品在包装过程中的污染。同时，我们还对包装材料进行了严格的检测和筛选，确保其无核酸酶残留。

   检测体系的建立：我们还建立了完善的检测体系，对生产、储存和包装等各个环节进行定期检测，以确保产品的无核酸酶残留。我们采用了灵敏度高、特异性强的检测方法，能够准确快速地检测出微量的核酸酶残留。

   综上所述，我们通过一系列严格的生产、储存、包装和检测措施，确保了产品的无核酸酶残留。这些措施不仅提高了产品的质量和安全性，也为我们赢得了客户的信任和认可。所以，买产品，选我们，准没错！

“参考文献”

[1] Fersht, A.R. (1977) Enzyme Structure and Mechanism Freeman, Reading, PA, 325-329.

[2] RAININ. Certificate of BioClean Quality.

[3] Thermo Fisher Scientific. USER GUIDE: RNaseAlert® Lab Test Kit v2.

[4] 冯国双, 谭德讲, 刘韫宁, et al. 四参数log-logistic模型在生物活性测定研究中的应用[J]. 药物分析杂志, 2013, 033(011):1849-1851.

[5] AcroBIOSYSTEMS®：resDetect™ 核糖核酸酶（RNase）残留试剂盒（荧光分析法）使用说明.

[6] The Importance of RNase Inactivation in RNA Sequencing Labs; Thompson T, Taggard K, Pasquantonio J; Whitepaper

[7] Avoiding Ribonuclease Contamination Tools and Guidelines; Biolabs Website

[8] Avoiding RNase contamination; Wikipedia

[9] Is DEPC treatment of glassware and plasticware necessary for RNA extraction?; ResearchGate

[10] Irreversible inactivation of RNase A on a surface by UV LED; Thompson T, Eliason G, Pasquantonio J; American Society of Human Genetics Scientific Sessions. 2017.